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基于SPR技术的表皮生长因子受体与新疆紫草中4种活性成分的相互作

添加时间:2018-03-14 09:44
  摘要:目的:以人表皮生长因子受体 (EGFR) 为靶标, 从左旋紫草素, 乙酰紫草素, β, β-二甲基丙烯酰紫草素, β-乙酰氧基异戊酰紫草素等新疆紫草所含的4种萘醌类活性成分中筛选潜在的EGFR抑制剂。方法:利用表面等离子体共振 (SPR) 技术, 首先通过预吸附实验, 优化固定的pH和浓度, 选择最佳条件, 构筑EGFR生物芯片。在此基础上, 以pH 7.4, 浓度10mmol·L-1的磷酸缓冲溶液 (含0.005%聚山梨醇酯-20) 作为相互作用时的缓冲溶液, 实时动态研究EGFR与4种单体的相互作用。通过软件计算动力学参数, 基于结合动力学常数大小, 筛选抑制剂。结果:选择pH 4.5, 10 mmol·L-1的乙酸缓冲液、含量为10 mg·L-1的EGFR为其最佳的固定条件, 最终固定量为250 RU.相互作用结果显示4种单体中, β, β-二甲基丙烯酰紫草素与EGFR有明显的结合作用, 其他3种单体无明确响应。动力学参数计算结果显示, EGFR与β, β-二甲基丙烯酰紫草素相互作用的结合速率常数ka为1.27×104 L·mol-1·s-1, 解离速率常数kd为2.92×10-2s-1, 解离平衡常数KD为2.31×10-6mol·L-1, 卡方值 (Chi2) 为3.25.KD<10-5mol·L-1, 表明他们有较强的亲和力。结论:β, β-二甲基丙烯酰紫草素可能为EGFR的一种抑制剂。
  
  关键词:表皮生长因子受体; 新疆紫草; 表面等离子体共振技术; β, β-二甲基丙烯酰紫草素。
  
  恶性肿瘤是当前威胁人类健康和生命的世界三大顽症之一。世界卫生组织 (WHO) 2014年发布的《世界癌症报告》中显示, 2012年全球新增癌症1410万例, 其中我国新增病例位居世界首位。预计未来20年内, 每年新增患者将多达2 398万[1].我国发布的《2015年中国肿瘤登记年报》中显示新增病例337.2万癌症, 癌症死亡221.3万, 位居发病死亡率首位[2].如何遏制肿瘤疾病的发展并有效降低其死亡率已成为医学界正面临的严重挑战之一。
  
  解决该问题的策略之一是研发高效的抗肿瘤药物。在众多类型中, 以蛋白酶为靶标的分子靶向药物因具有特异性强、耐药性低、毒副反应低等优点而异军突起, 已成为抗肿瘤药物研发的主要方向[3-4].当前70%以上的分子靶向药物是以酪氨酸蛋白激酶为靶标的抑制剂[2].
  
  表皮生长因子受体 (Epidermal growth factor receptor, EGFR) 作为受体酪氨酸激酶家族的一种常见的跨膜蛋白, 广泛分布于哺乳动物的上皮细胞。现代医学研究表明, 许多实体肿瘤的发生、发展、愈后不良等与EGFR的过量表达密切相关, 阻断EGFR信号转导则能有效的抑制肿瘤的生长[5], 它是分子靶向药物研究的重要靶点之一[2,6].
  
  天然产物中蕴含丰富的类型多样的活性成分, 是新药发现的源头和基础。从植物中发现或筛选新型高效的酶抑制活性物质一直是众多医药研究者孜孜以求的目标[7].近年来药理学研究发现, 我国特色民族药材新疆紫草Arnebia euchroma能明显降低EGFR及酪氨酸激酶水平, 抑制多种肿瘤细胞生长增殖[8-9], 可能存在酪氨酸激酶抑制剂成分。
  
  目前, 有关新疆紫草抗肿瘤作用的研究多集中于新疆紫草粗提物细胞实验[10-11], 而对于其各种单体成分的抗肿瘤靶向分子研究则较少。因此, 进一步研究新疆紫草中的单体组分与EGFR的相互作用, 探索筛选其中酶抑制剂成分, 对于新型抗肿瘤靶向药物的研发具有重要意义。
  
  酶抑制剂筛选方法主要分为细胞筛选和生化测定筛选两大类。相对于前者, 生化测定筛选方法因具有快速简单有效等优点, 得到了广泛应用[7,12].生化测定筛选方法主要包括光谱法, 色谱法, 质谱法, 表面等离子体共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 等。其中SPR技术作为近年来药物高通量筛选方法, 具有免标记, 实时, 快速等优点, 可以从大量化合物中快速筛选出与酶有较大结合力的潜在的酶抑制剂, 比传统药物筛选方法省时、省钱和省力[13].许多研究者利用SPR技术开展了药物筛选相关研究。如邓宏伟等[14]研究了小分子NSC51186与EGFR的相互作用。笔者基于SPR技术, 研究了血清白蛋白与色氨酸对映异构体的手性识别相互作用[15].
  
  本文以EGFR为靶标分子, 构筑EGFR生物芯片, 研究了其与新疆紫草中萘醌类色素化合物的4种单体活性成分, 左旋紫草素, β, β-二甲基丙烯酰紫草素, 乙酰紫草素及β-乙酰氧基异戊酰紫草素的相互作用, 从中筛选出了与EGFR有较强结合力的β, β-二甲基丙烯酰紫草素。相关研究可为新型抗肿瘤分子靶向药物的研究提供参考。
  
  1 材料。
  
  Proten On XPR36型生物分子相互作用系统;GLH型传感芯片氨基偶联试剂盒 (批号8800630) , 包括N-羟基硫代琥珀酰亚胺 (Sulfo-NHS) , N-乙基-N'- (二甲氨基丙基) 碳二亚胺 (EDC) , 1 mol·L盐酸乙醇胺 (p H 8.5) ;固定化缓冲试剂盒 (批号8800503) , 包括4种浓度为10 mmol·L, p H分别为4.0, 4.5, 5.0, 5.5的乙酸缓冲液;芯片再生试剂盒 (批号8801160) 包括0.5%SDS, 50 mmol·LNa OH, 100 mmol·LHCl, 以上试剂均购自美国BioRad公司。人EGFR (批号029K4078) 购自美国Sigma公司。新疆紫草的4种单体, 包括左旋紫草素, β, β-二甲基丙烯酰紫草素, 乙酰紫草素及β-乙酰氧基异戊酰紫草素由实验室分离提取制备, 纯度≥95%, 结构经NMR和MS确证。其余分析纯试剂购自北京化学试剂公司。
  
  运行缓冲液 (PBST) 由10 mmol·LNa3PO4和150 mmol·LNa Cl配制, 用HCl调节p H至7.4, 加入0.005%聚山梨醇酯20, 使用前经0.22μm微孔滤膜过滤。p H由德国Sartorius PB-10 p H计测定。实验用水为美国Millipore公司Milli-Q纯水系统提供的去离子水。
  
  2 实验方法。
  
  2.1 EGFR在芯片上的固定。
  
  EGFR固定采用氨基偶联法[15].首先进行预吸附实验, 确定EGFR在芯片上的最佳固定条件。预实验步骤为在0.1 mL超纯水中加入EGFR 10μg, 使其充分溶解, 再用p H分别为4.0, 4.5, 5.0, 5.5的乙酸缓冲液稀释10倍。之后将不同p H的EGFR溶液分别同时注入芯片通道, 根据信号响应单位 (Response Unit, RU) 选取适宜的p H;在选定的p H下分别配制质量浓度为5, 10, 20 mg·L的EGFR溶液, 依据RU确定EGFR在芯片上的最佳结合浓度。设置流速25μL·min, 时间350 s.然后进行EGFR固定, 步骤如下, (1) 将0.05 mol·LSulso-NHS和0.2 mol·LEDC按1∶1混合后, 以25μL·min的流速流过传感芯片通道, 时间200 s; (2) 以预吸附实验确定的p H和浓度配制EGFR溶液, 使其与芯片上活化的羧基反应, 流速25μL·min, 时间200 s; (3) 用盐酸乙醇胺封闭残余活化的羧基, 流速25μL·min, 时间200 s; (4) 注入缓冲液, 除去非特异性吸附。另设第2个通道作为对照, 只进行活化和封闭而不标记EGFR.
  
  2.2 样品配制。
  
  实验所用左旋紫草素等4种物质均由含5%DMSO的运行缓冲液PBST配制。最高浓度均为0.5 mmol·L, 经2倍倍比稀释得5个浓度梯度。另设置一个只含有5%DMSO的PBST的溶液作为空白对照。
  
  2.3 相互作用。
  
  上述实验全部在25℃进行。待EGFR在芯片表面固定好之后, 同一单体的6种浓度系列同时以30μL·min的流速垂直流过EGFR固定通道并与其作用。实时采集响应信号, 结合时间为200 s, 解离200 s.
  
  2.4 数据处理。
  
  利用Proten On Manager 2.1.2软件进行动力学分析处理, 分别计算各单体与EGFR的结合速率常数ka, 解离速率常数kd和解离平衡常数KD等相关参数。
  
  3 结果。
  
  3.1 EGFR的固定。
  
  以p H 4.5, 质量浓度10 mg·L作为EGFR最终的标记条件。图1显示了EGFR在芯片表面的动态固定曲线, 其固定量为250RU.该值较BSA等蛋白大大降低[15], 这可能与其本身的结构有关。但与文献[14]报道的EGFR固定量 (230 RU) 相比, 该方法的固定量明显提高。
 
  
 
  3.2 EGFR与4种活性成分相互作用的动力学试验。
  
  以EGFR为靶标, 利用SPR实时研究了它与新疆紫草中4种单体分子的相互作用。实验结果显示, 在4种单体分子中, β, β-二甲基丙烯酰紫草素与EGFR有较强的相互作用, 其余3种则没有明确响应 (结果没有显示) .图2显示了β, β-二甲基丙烯酰紫草素与EGFR的动态相互作用曲线。

 
  
 
  3.3 动力学参数。
  
  据Langmuir等温吸附模型, 假设芯片表面双分子反应遵循假一级反应动力学公式[16]:.其中, A为分析物;B为结合在芯片上的蛋白;AB为芯片表面的结合物;ka是吸附过程的结合速率常数;kd是脱附过程的解离速率常数。
  
  该反应结合阶段的动力学方程可表示为:dR/dt=kaCRmax- (kaC+kd) R (1) R为结合物时间t的响应信号;dR/dt为结合物响应信号的变化速率;C为分析物浓度;Rmax为结合物的最大量。结合反应的解离平衡常数KD定义为KD=kd/ka (2) .根据公式, 利用Proten On Manager 2.1.2软件可计算出EGFR对β, β-二甲基丙烯酰紫草素相互作用的动力学参数, 分别为ka=1.27×10L·mol·s, kd=2.92×10s, KD=2.31×10mol·L, Rmax=51.3, 卡方值 (Chi) =3.25.因其他3种物质无明显的结合曲线, 很难拟合出它们的动力学数据。
  
  KD反应了分子间结合能力的大小, KD越小, 表明结合力或亲和力越大。一般情况下, KD在10~10表明亲和力较强。由实验KD值可看出, EGFR与β, β-二甲基丙烯酰紫草素有很强的亲和力。Chi小于Rmax的10%, 在统计学中是可信的。
  
  抑制剂对酶的抑制作用与它们之间的亲和性存在相关性[17].抑制剂与酶的亲和力越大, 结合就越牢固, 抑制作用也越强。结合的动力学性质实质反应了其生物活性。β, β-二甲基丙烯酰紫草素与EGFR有很强的亲和力, 揭示其可能为EGFR的一种抑制剂。
  
  4 讨论。
  
  4.1 EGFR固定条件的选择。
  
  在EGFR固定前, 需要进行预吸附试验, 摸索适宜的标记条件。溶液的p H和浓度是影响蛋白标记量的最主要因素。
  
  4.1.1 p H的影响。
  
  采用质量浓度同为10 mg·L, 不同p H的EGFR进行预吸附试验。EGFR一般通过预先接在金膜表面的羧基进行连接。当蛋白带正电荷时更易吸附在羧基表面, 利于发生偶联反应, 所以一般选择EGFR溶液的p H小于其等电点。但当p H降到一定值时, 修饰表面的负电荷将起决定作用, 会导致吸附量降低。考虑到EGFR的等电点为5.6, 实验选择的p H分别为4.0, 4.5, 5.0, 5.5.实验发现EGFR在p H 4.5时吸附量最高, 表明p H过低或过高都不利于吸附。为此, 选择此条件作为EGFR溶液的p H.
  
  4.1.2 浓度的影响。
  
  增加EGFR的浓度会相应地增大固定量, 但浓度过高又会造成试剂浪费。最佳条件应是满足实验需求的最低EGFR浓度。实验进一步考察了p H 4.5时EGFR吸附量随质量浓度 (5, 10, 20 mg·L) 的变化。研究发现在起始阶段, 吸附量随EGFR浓度增大而增大, 而且吸附速率非常快;在质量浓度为10 mg·L时吸附量达到最大;但当EGFR达到20 mg·L后, 浓度虽然增大1倍而吸附量却呈下降状态。结合文献[15]和预吸附试验, 特别是考虑到分析物的相对分子质量<250 Da, 最终选择10 mg·L作为EGFR的标记浓度。
  
  4.2 重复性试验。
  
  在另一块芯片上3个通道上并行固定同一浓度的EGFR分子, 平行考察与4种单体分子的相互作用。还比较了4种单体分子与不同固定浓度的EGFR分子的相互作用。重复结果均显示β, β-二甲基丙烯酰紫草素与EGFR有较强作用, 其余3种无响应。表明该方法具有良好的重复性。
  
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