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sTLR4的研究进展

添加时间:2018-05-08 10:46
  摘要:TLR4是第一个被发现的哺乳动物的Toll样受体 (TLRs) , 广泛表达于哺乳动物细胞表面, 能识别病原体的入侵, 通过识别配体, 激活核转录因子kappa B (NF-κB) , 进而触发炎症反应。近年来, 在体液中发现了一种可溶性形式TLR4 (s TLR4) .s TLR4来自TLR4 mRNA的可变剪切, 广泛存在于各种体液中。s TLR4主要通过与MD-2形成复合体, 抑制LPS信号通路, 从而抑制LPS引起的炎症反应。s TLR4作为炎症的诊断工具;作为某些炎症的拮抗剂, 抑制炎症反应;替代细胞膜上TLR4受体的胞外域, 用于研究信号分子与TLR4的相互作用;作为某些癌症的预后指标。
  
  关键词:sTLR4; 可变剪切; 炎症反应; 癌症;
  
  1 s TLR4的概述
  
  1.1 s TLR4的来源
  
  TLR4受体属于Ⅰ型跨膜糖蛋白, 结构上主要由胞外域、跨膜域和胞内域构成。其胞外域由富含亮氨酸的重复序列组成, 能结合相关配体。跨膜域是介导信号转导的主要结构。胞内域进化保守, 因其结构类似于IL-1受体, 故称为TIR (Toll/IL-1 receptor) 区。TLR4的固有配体主要有细菌脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS) 、热休克蛋白 (Heat shock protein, HSP) 60、软脂酸等[1].
  
  一个基因的不同外显子和内含子可以组合并一起被剪切下来, 从而产生出不同的mRNA.一个外显子或内含子是否被剪切保留在成熟的mRNA中也是可以变化的, 故称之为可变剪切。Pre-mRNA可变剪切过程在真核生物中极为普遍, 尤其是脊椎动物。TLR4的mRNA前体在成熟过程中会进行选择性剪切, 产生TLR4 mRNA亚型。Iwami等[2]在研究中发现, 用DNA印迹技术可检测到多种TLR4mRNA亚型。其中一种亚型与成熟TLR4 mRNA大致相同, 区别在于第二和第三个外显子之间有额外的144 bp的插入序列, 此144 bp插入序列可在TLR4 mRNA的基因组文库中发现, 且符合碱基互补配对规则, 是TLR4 mRNA选择性剪切产物。此段插入序列在110 bp处有一个框内终止密码子, 可编码一种稳定存在的可溶性的蛋白质, 即s TLR4.杜金苓等[3]发现绵羊TLR4基因存在3种剪接体形式, 除正常TLR4外将两种新型剪接体分别命名为Var2-TLR4和Var3-TLR4.Var2-TLR4在第2外显子与第3外显子之间有222 bp碱基的插入, 但在插入序列中提前出现终止密码子, 导致Var2-TLR4可能出现一个由86个氨基酸构成的蛋白, 这种情况与鼠s TLR4非常相似。
  
  1.2 s TLR4的作用机制
  
  研究中发现, 额外的144bp插入序列编码122aa的蛋白质, 开始的86aa与TLR4胞外域相同, 只有87~122aa不同[2].由于s TLR4与TLR4胞外域结构上极为相似, Hyakushima等[4]人工制备一种可溶形式的缺少胞质域和跨膜域的TLR4, 包含推测的胞外域 (Met1-Lys631) .结合试验证明了s TLR4能与髓样分化蛋白2 (Myeloid differentiation protein-2, MD-2) 结合, 而且s TLR4/MD-2复合体能结合LPS, 单独的s TLR4则不能结合LPS, 且s TLR4/LPS复合体能抑制LPS诱导的TLR4/NF-κB信号通路激活[4-6].因此, s TLR4能与MD-2形成复合体, 与细胞膜上的TLR4信号复合体竞争性结合LPS等配体, 阻断TLR4信号通路, 从而抑制LPS等配体引起的炎症反应。
  
  1.3 s TLR4的分布
  
  编码s TLR4的TLR4 mRNA亚型广泛存在于多种组织中, 包括脑、心、肾、胸腺、脾、小肠和睾丸。s TLR4也在多种体液中存在, 包括唾液、血清、关节液、脑脊液、羊水和胸腹水。Zunt等[7]在健康人的静息唾液中发现了s TLR4, 并且有4种不同大小的s TLR4, 分子质量分别为90、78、54和44 k D, 但只有90 k D的s TLR4有生理活性。在健康人的血清中也可检测到s TLR4, 但是浓度极低。有文献报道, 在LPS直接刺激后, 血液中会释放大量的细胞因子、趋化因子以及s TLR4[8].用酶联免疫吸附试验 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 可检测到关节液中的s TLR4, 并且不同部位关节液中s TLR4含量不同, 掌腕关节关节液中s TLR4含量高于膝盖关节液[9].健康人脑脊液中也可检测到s TLR4, 脑脊液中s TLR4水平明显高于血清中s TLR4水平, 并且在人类免疫缺陷病毒感染且患有认知障碍的患者脑脊液中s TLR4水平显着高于正常人[10].妊娠期妇女体内羊水也能检测到s TLR4, 羊水中s TLR4水平随着羊膜腔微生物入侵而升高[11].
  
  2 s TLR4的应用
  
  2.1 作为炎症的拮抗剂, 抑制炎症反应
  
  s TLR4与TLR4胞外域在结构上极为相似, 能与细胞膜上的TLR4竞争性结合配体, 阻断TLR4信号通路, 抑制配体引起的炎症反应。Mitsuzawa等研究证明s TLR4与MD-2结合, s TLR4/MD-2复合体能与细胞表面TLR4受体复合物竞争性结合LPS, 显着降低LPS诱导的NF-κB活化和IL-8的分泌[4,5].在小鼠气管输注LPS能引起小鼠肺部炎症。在LPS输注后气管输注s TLR4/MD-2复合体后支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞浸润和TNF-α的水平显着降低, 有效抑制LPS诱导的小鼠肺部炎症[5].Katharina等设计了一种LPS“陷阱”, 将MD-2融合到s TLR4的羧基末端, 发现其在体外能结合LPS, 抑制LPS诱导的TNF-α的产生[12].Goncalo等[13]发现在条件培养基中加入不含MD-2的s TLR4能显着减少Co2+或Ni2+诱导的IL-8的产生量, 而LPS诱导的IL-8的表达未受影响。
  
  2.2 研究信号分子与TLR4的相互作用
  
  s TLR4与TLR4胞外域结构极为相似, 能与TLR4配体结合, 可以利用s TLR4代替TLR4胞外域, 研究信号分子与细胞膜上TLR4受体的相互作用。
  
  在研究中草药小青龙汤对于过敏炎症反应的抑制作用时发现, 小青龙汤能降低屋尘螨引起的细胞TLR4表达, 加入s TLR4或粗糙型沙门菌LPS能减弱小青龙汤对于神经生长因子和胸腺基质淋巴细胞生成素的抑制效果, 小青龙汤能抑制人类肺泡上皮细胞的p75神经营养因子受体和NF-κB的Ser536磷酸化, 而s TLR4能削弱此抑制效应, 证明小青龙汤可能通过有细胞膜上TLR4参加的信号通路抑制过敏炎症反应[14].
  
  在研究MBL对白色念珠菌诱导的细胞反应的影响时, 发现MBL能减低白色念珠菌诱导的TLR4表达, 用抗TLR4抗体能抑制MBL与白色念珠菌诱导的细胞结合, 提示TLR4是MBL作用位点。免疫共沉淀试验显示MBL能与s TLR4共沉淀, 进一步验证了MBL与TLR4的相互作用[15].
  
  在研究人类β防御素 (Humanβ-defensin 3, HBD-3) 调节免疫反应的机制时, 用s TLR4代替TLR4胞外域, 发现s TLR4能与HBD-3结合, 且s TLR4能竞争性抑制HBD-3与im DC结合, 证明HBD-3与im DC的结合位点与TLR4有关[16].
  
  在研究代谢标记的脂低聚糖 (Lipooligosaccharide, LOS) 和MD-2的纯化复合物[3H]LOS-MD-2与放射性碘化标记内毒素-MD-2复合体LOS-MD-2[125I], 这两种复合物与TLR4的结合性能, 用s TLR4直接比较两种标记LOS-MD-2的与细胞膜上TLR4受体结合性能[17].
  
  2.3 作为炎症诊断工具
  
  TLR4作为先天性免疫应答的重要受体, 能识别病原体相关分子模式 (Pathogenassociated molecular patterns, PAMPs) 和危险相关分子模式 (Danger-associated molecular patterns, DAMPs) , 偶联信号转导途径, 诱导NF-κB的活化, 产生大量的炎症因子。TLR4基因敲除可使机体尤其是内脏脂肪组织处于低度炎症状态, 免疫细胞的数量和比例失调[18].s TLR4被认为是TLR4的负调节机制之一, 在炎症时水平会升高, 可作为炎症诊断的生物标志物。
  
  在口腔扁平苔藓患者的静息唾液中, 检测到s TLR4水平显着升高[7].Ten等深入探究各种炎症疾病中s TLR4的水平, 发现感染性炎症患者的血清s TLR4水平显着高于非感染性炎症患者;对比病毒感染患者, 细菌感染患者的超敏C反应蛋白和s TLR4浓度更高[8].在患骨关节炎的患者的掌腕关节和膝关节的关节液中s TLR4水平显着高于正常人[9].在动脉瘤蛛网膜下腔出血患者的脑脊液中, s TLR4水平随时间推移显着上升, 但是有一定的延迟[19].在非酒精性脂肪肝和肝纤维化患者中, 血清s TLR4水平显着高于正常人[20], s TLR4水平随肝纤维化程度加深而升高, 在一定程度上能预测非酒精性脂肪肝和肝纤维化以及疾病的进展。在乙型肝炎病毒e抗原 (HBe Ag) 阴性的慢性病毒性乙型肝炎患者的血清s TLR4水平显着高于正常人[21], 且与HBV DNA及丙氨酸氨基转移酶水平成正相关。
  
  2.4 s TLR4在癌症中的作用
  
  研究证明在结肠癌、乳腺癌[22]、胃癌等不同的肿瘤组织中, TLR4的表达较正常组织均有所升高。TLR4的活化能引起促炎因子和其他介质的产生来抵抗病原微生物, 而TLR4的过度表达则会促进肿瘤的发生、发展、免疫逃避[23].而s TLR4作为TLR4的负调节机制之一, 在癌症患者的血清中水平显着升高, 与癌症患者的预后有密切关系。
  
  在研究非小细胞型肺癌 (NSCLC) 患者的预后时发现NSCLC患者血清中s TLR4水平显着高于正常人, Ⅱ期或Ⅲ期NSCLC患者的血清s TLR4水平明显高于Ⅰ期NSCLC患者, 而Ⅳ期NSCLC患者血清s TLR4明显低于Ⅲ期NSCLC患者, 即在局限性NSCLC中血清s TLR4水平随TMN分期增加而增加, 而在转移性NSCLC患者中, s TLR4水平显着降低[24].此外, TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期的癌症组织中TLR4表达水平与血清s TLR4水平呈负相关, 而在全阶段患者和Ⅲ期患者中TLR4表达与血清s TLR4水平无明显相关性[25].血清s TLR4水平与NSCLC的病理类型也有关系, 鳞癌患者血清s TLR4水平显着高于腺癌患者。在血清s TLR4水平高组的NSCLC患者的平均总存活数显着高于s TLR4低组, 证明血清s TLR4高预示癌症预后良好。
  
  探究结直肠癌的新型治疗方法时, 发现s TLR4/MD-2复合物可在体外和体内试验中通过下调长链非编码RNA (IncRNA) H19表达来抑制结直肠癌的迁移和侵袭[26].此外, 研究人员发现在多发性骨髓瘤患者的血清中, s TLR4的浓度显着高于正常人, 而且多发性骨髓瘤不同时期的血清s TLR4浓度也有差异, Ⅱ期组血清s TLR4浓度显着高于Ⅰ期组, Ⅲ期组血清s TLR4浓度显着高于Ⅱ期组, 表明血清s TLR4浓度检测可用于多发性骨髓瘤的早期诊断[27].
  
  3 总结
  
  s TLR4作为TLR4的负调节机制之一, 在炎症反应中水平显着升高, 因而能作为炎症反应的生物标志物。然而, s TLR4在鉴别感染性炎症与非感染性炎症以及细菌性感染与病毒性感染时的准确性并不能超过超敏C反应蛋白[8], 因而只能作为鉴别炎症类型的辅助诊断手段。而且, 脑脊液中的s TLR4释放延迟, 会对炎症的及时诊断产生影响。在研究罗素伐他汀对于未治疗的HIV患者的免疫活化标志物的作用时发现, HIV患者血清s TLR4与正常人相比无显着差异[28], 这与其他研究有很大差异, s TLR4作为炎症标志物的准确性有待进一步验证。
  
  s TLR4在结构上与TLR4胞外域极为相似, 可竞争性抑制细胞膜上TLR4与其配体结合, 因而能阻断TLR4信号通路, 从而抑制相关配体引起的炎症反应。但是s TLR4单独并不能结合LPS等配体, 必须要与单体MD-2形成复合物才能与细胞膜表面TLR4竞争性结合配体, 大剂量的MD-2很难制备, 状态不稳定, 易沉积形成大量无活性的二硫化低聚体, 为s TLR4的应用带来了困难。此外, 这些试验只是验证在体外和小鼠体内, 在其他动物甚至人类体内s TLR4/MD-2能否抑制炎症反应还有待进一步验证。
  
  总之, 尽管存在种种限制和未知, s TLR4的发现意义重大, 不仅能作为TLR4的一种负调节机制, 还能作为炎症的拮抗剂, 抑制炎症;作为炎症的生物标志物, 预示体内出现炎症反应;作为某些肿瘤的标志物, 反映肿瘤预后;代替TLR4胞外域, 验证各种信号分子与TLR4的相互作用。
  
  参考文献
  
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  [5]Mitsuzawa H, Nishitani C, Hyakushima N, et al.Recombinant soluble forms of extracellular TLR4 domain and MD-2 inhibit lipopolysaccharide binding on cell surface and dampen lipopolysaccharide-induced pulmonary inflammation in mice[J].Immunology, 2006, 177 (11) :8133-8139.  
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